Nos vemos en 6to semestre

Antiséptico

Los antisépticos  son sustancias antimicrobianas que se aplican a un tejido vivo o sobre la piel para reducir la posibilidad de infección, sepsis o putrefacción. En general, deben distinguirse de los antibióticos que destruyen microorganismos en el cuerpo, y de los desinfectantes, que destruyen microorganismos existentes en objetos no vivos. Algunos antisépticos son auténticos germicidas, capaces de destruir microbios (bactericidas), mientras que otros son bacteriostáticos y solamente previenen o inhiben su crecimiento.

Características de los antisépticos

Entre las características más comunes de los antisépticos (y desinfectantes) se encuentran:

·         Amplio espectro

·         Poder germicida

·         Excelente penetración

·         Selectividad de acción

·         Efecto rápido y duradero

Funcionamiento

Para que sea posible el desarrollo de las bacterias debe haber cierta provisión de alimento, humedad, en muchos casos oxígeno, y una temperatura mínima . Estas condiciones han sido especialmente estudiadas y aplicadas en relación con la conservación de los alimentos y la antigua práctica del embalsamamiento de cadáveres, que es el más antiguo ejemplo del uso sistemático de antisépticos.

En las primeras investigaciones un punto fundamental era la prevención de la putrefacción, y las investigaciones se dirigían a determinar qué cantidad de un agente debía añadirse a una solución dada para que las bacterias presentes accidentalmente no prosperaran. Pero por varias razones éste era un método inexacto, y hoy en día un antiséptico es valorado por sus efectos sobre cultivos puros de microbios patogénicos determinados, y sobre sus formas vegetativas y esporas. Su estandarización se ha llevado a cabo de varias maneras, y actualmente se toma una solución acuosa de fenol de una fuerza determinada como el estándar con el cual se comparan los otros antisépticos.

Antibiótico

Un antibiótico es una sustancia química producida por un ser vivo o derivado sintético, que mata o impide el crecimiento de ciertas clases de microorganismos sensibles, generalmente bacterias. Los antibióticos se utilizan en medicina humana, animal y horticultura para tratar infecciones provocadas por gérmenes. 

Normalmente los antibióticos presentan toxicidad selectiva, siendo muy superior para los organismos invasores que para los animales o los seres humanos que los hospedan, aunque ocasionalmente puede producirse una reacción adversa medicamentosa, como afectar a la flora bacteriana normal del organismo. Los antibióticos generalmente ayudan a las defensas de un individuo hasta que las respuestas locales sean suficientes para controlar la infección. Un antibiótico es bacteriostático si impide el crecimiento de los gérmenes, y bactericida si los destruye, pudiendo generar también ambos efectos, según los casos.

El objetivo del tratamiento con antibióticos es conseguir la erradicación del microorganismo patógeno. Para ello es necesario seguir una posología que consiga que en el foco de la infección se alcance una concentración del medicamento superior a la mínima concentración capaz de inhibir al microorganismo durante el tiempo suficiente. La automedicación con antibióticos supone un serio problema de salud pública, pues la inadecuada elección del antibiótico y, especialmente, una incorrecta posología, puede generar poblaciones de bacterias resistentes a dicho antibiótico. 

Por otro lado, los antibióticos y antimicrobianos son totalmente inefectivos en las enfermedades virales, por lo que su uso debe evitarse en estos casos

Antibiograma

El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad  de una bacteria a un grupo de antibióticos. Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones.

Se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilización como tratamiento en los pacientes.
El antibiograma es un método de diagnóstico rápido y preciso

Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibiótico más adecuado para el tratamiento de una enfermedad.

El antibiograma tiene tres utilidades principales:

-       La utilidad básica del antibiograma es la instauración de un tratamiento antibiótico correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infección posee mecanismos que le confieran inmunidad frente a algún antibiótico para no incluirlo como terapia.

-       En cuanto al tratamiento el antibiograma no sólo es necesario en la instauración, también resulta útil en el seguimiento e incluso en la confirmación de tratamientos empíricos. En ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El antibiograma tiene que confirmar, o en su caso corregir el tratamiento.

-       Otra aplicación de las técnicas de estudio de resistencia es la epidemiología. Es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clínicos para tomar medidas correctoras.

Por otro lado también puede tener utilidad diagnóstica porque el perfil de resistencia puede en algún caso orientar en la identificación bacteriana.

Los criterios que se siguen para seleccionar que antimicrobianos se ensayan responde a factores de diversa índole:

-       Factores microbiológicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de resistencia descritos previamente en su especie.

-       Factores farmacológicos: Tipo de antimicrobiano y parámetros de absorción, distribución y eliminación.

-       Factores del paciente: Tipo de infección. Factores de riesgo y estado general de salud. Situación inmunológica e hipersensibilidad.

Como relizarlo

Se siembra, con el gérmen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la superficie del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibiótico o quimioterápico a ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observará un halo, en el cual no hay proliferación de bacterias. Si el germen es resistente al antibiótico, crecerá uniformemente y no habrá ningún halo de inhibición en torno al disco de papel.

Preparación de los discos impregnados de antibiótico para realizar un antibiograma.

En las casas de productos de laboratorio pueden adquirir se los discos que se emplean para hacer un antibiograma. Sin embargo, como aprendizaje, y con bastante fiabilidad, es fácil prepararlos a partir de las cápsulas, comprimidos grageados o viales de 250 mg ó 500 mg de los antibióticos que expenden en las farmacias.

Para que la concentración de antibiótico que impregna los discos no sea ni excesiva ni insuficiente, y sea posible distinguir los halos de inhibición, se puede proceder del siguiente modo, realizando un banco de diluciones.

La concentración de 0,1 mg/cl ya es adecuada para trabajar.

Para evaluar, aproximadamente, el volumen de una gota se pueden colocar en una probeta graduada 100 gotas calculando el volumen que ocupan; dividiendo por 100 tendremos el volumen que corresponde a una gota. Suponiendo que el volumen hallado para una gota sea de 0,003 ml, la expresión 0,1 x 0,003 nos dará la concentración de antibiótico en mg/ gota. De este modo sabremos la concentración de antibiótico con que impregnamos los discos de papel secante, que se acostumbran a tomar de 6,5 mm de diámetro. Repitiendo la operación con cápsulas de distintos antibióticos podremos preparar diferentes discos.

Los distintos microorganismos tienen distintas exigencias tanto en los que se refiere al medio nutritivo en sí como a la temperatura de incubación ya las condiciones atmosféricas. Casi todos los microorganismos pueden cultivarse en medios nutritivos inertes. Hay medios de cultivo líquidos y sólidos; de hecho los sólidos son medios de cultivo líquidos a los que se adicionan diferentes sustancias, las más utilizadas son el agar y la gelatina.

Lectura del antibiograma.

 Una vez sembrada una placa de un medio de cultivo adecuado y colocados los distintos discos im pregnados de antibiótico y una vez colocada a incubación en la estufa durante unas horas, se procede a la lectura de los resultados, que puede hacerse a intervalos periódicos, basada en la medi ción del halo de inhibición. Según la amplitud de este halo los gérmenes se clasifican en:

RESISTENTES

SENSIBLES

MUY SENSIBLES

Debe tenerse presente que el diámetro del halo de inhibición depende también de la difusibilidad del antibiótico y, por tanto, no es una medida absoluta de la eficacia.

Cuestionario

¿Que son la Cianobacterias?

Las cianobacterias son organismos antiguos que se caracterizan por conjugar el proceso de la fotosíntesis oxigénica con una estructura celular típicamente bacteriana. Al ser responsables de la primera acumulación de oxígeno en la atmósfera, las cianobacterias han tenido una enorme relevancia en la evolución de nuestro planeta y de la vida en él. 2. ¿Por qué se le llama a la cèlula Procariota? Se llama procariota a las células sin núcleo celular definido, es decir, cuyo material genético se encuentra disperso en el citoplasma, reunido en una zona denominada nucleoide. 3. ¿Por qué se le llama a la célula Eucariota? Se llama célula eucariota a todas las células con un núcleo celular delimitado dentro de una doble capa lipídica: la envoltura nuclear, la cual es porosa y contiene su material hereditario, fundamentalmente su información genética. Las células eucariotas son las que tienen núcleo definido (poseen núcleo verdadero) gracias a una membrana nuclear. 5. ¿Qué son las arqueobacterias? Las Archaea, arqueas o arqueobacterias, son un grupo de microorganismos unicelulares de morfología procariota (sin núcleo ni, en general, organelos membranosos internos), que forman uno de los tres grandes dominios de los seres vivos, y que son diferentes de las bacterias. 6.¿ Què caracteristicas tienen las arqueobacterias? Las Archaea generalmente se reproducen por fisión, como la mayoría de las Bacterias. Los genomas de Archaea son de un tamaño sobre 2-4 Mbp, similar a la mayoría de las Bacterias. Si bien lucen como bacterias  poseen características bioquímicas y genéticas que las alejan de ellas. Por ejemplo: -       -No poseen paredes celulares con peptidoglicanos -       -presentan secuencias únicas en la unidad pequeña del ARNr -       -poseen lípidos de membrana diferentes tanto de las bacterias como de los  eucariotas (incluyendo enlaces éter en lugar de enlaces éster). 7. ¿Què son las bacterias? Las bacterias son organismos unicelulares de diversas formas. Pueden tener diversas características según sean de animales o vegetales. Tienen estructuras poco complejas y son células procariotas, es decir, sólo tienen un cromosoma y no tienen membrana celular. 8.¿Que son las eubacterias? Nombre común de un grupo de organismos procariotas (que no tienen el material genético contenido en un núcleo definido con membrana nuclear).  Dentro de las eubacterias se incluyen la mayor parte de los organismos definidos como bacterias.  9. ¿Qué beneficios trae a la medicina las eubacterias? Además, las bacterias que viven en el tracto intestinal son también encargadas de ayudarnos a aprovechar al máximo las vitaminas y minerales de los alimentos, permitiendo que cada ingrediente que ingerimos sea usado al máximo para nutrirnos. Las bacterias están presentes también en nuestra piel, ayudando a mantener un Ph neutro para que la dermis y diferentes órganos estén protegidos contra la invasión de microorganismos que puedan resultar nocivos. 10. ¿Cuáles son las bacterias de beneficio para la salud? El Lactobacillus acidophilus, que significa bacteria láctica afín al medio ácido, es una bacteria beneficiosa que se encuentra en los intestinos y en la vagina. Produce vitamina K, bacteriocina, acidolina, lactasa y lactocidina, sustancias todas ellas necesarias para el procesamiento de los productos lácteos. El consumo humano de Lactobacillus ha demostrado ser provechoso por diversos motivos.  Las bacterias beneficiosas se encuentran básicamente en los intestinos, tanto en el delgado como en el grueso, pero concretamente en el colon. Estas bacterias forman la que conocemos como flora intestinal y es la encargada de que digiramos correctamente los alimentos y los aprovechemos al máximo. Estas bacterias son las encargadas de evitar infecciones intestinales y otras derivadas de una mala asimilación de los alimentos, además de ser una buna forma de prevenir enfermedades. Es importante que a la hora de alimentarnos ingiramos alimentos probióticos. Estos son los que contienen en su composición bacterias beneficiosas que nos ayudarán a repoblar la flora intestinal que se pierde a diario debido a nuestro ritmo de vida, el estrés y los diferentes cambios externos. Esta pérdida hace que en muchos casos nuestras defensas se vean reducidas y seamos más vulnerables al ataque de las bacterias nocivas para la salud. 11. ¿Que bacterias son las que abundan en la corteza de los árboles, rocas y suelos humedos? Estas son la mayoría de enfermedades que afectan a los árboles. Fitóftora (Phytophthora spp.) También se le llama "Enfermedad de los setos", porque es relativamente frecuente en setos de Thuyas (Thuja), Cipreses (Cupresus sp) y sobre todo en Leylandii. Phytophthora afecta a otras Coníferas como Cedros, Juniperus, Ciprés de Lawson, Tejo, etc., a la mayoría de árboles y arbustos.

CITRATO DE SIMMONS

El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, un compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como única fuente de carbono, utilizan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de Krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de  magnesio o manganeso y de transportadores como citrato permeasas.

La citritasa actúa sobre el citrato produciendo ácido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos enzimáticamente a piruvato y dióxido de carbono. Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO₂ que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromo timol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.

Técnica

Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por 24 horas.

Interpretación

El desarrollo de un color azul intenso  en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formación de productos alcalinos. La prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de inoculación.

Tinciones

TINCIONES DIFERENCIALES

Nos permite diferenciar entre grupos de bacterias que tienen distintas propiedades tintoriales. Las más utilizadas son la tinción de Gram y la tincion de Ziehi-Neelsen.

TINCIÓN DE GRAM

Fue desarrollada por Christian Gran e 1884, la diferencia en Gram positiva y la negativa  es que se establece en la naturaleza y con características de la pared celular bacteriana.
Poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la coloración con alcohol  acetona se provoca una deshidratación de la gruesa pared y la porosidad, atrapado al complejo en el interior de la célula.
Poseen una delgada capa de peptidoglicano.
En Gram positivas se observará de azul por el cristal violeta y no perderá coloración.

REACTIVOS Y COLORANTES

Primer colorante. Un colorante básico (+) que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. Es el cristal violeta.

Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Suelen se sales metálicas, ácidos o bases, una solución divida de yodo.

Agente de colorantes. Es un disolvente orgánico, alcohol acetona (1:1).

Colorante de contrastes. Es un colorante básico.

TINCIÓN DEL FROTIS

Fijar la muestra con calentamiento suave.

Cubrir el preparado con 2 gotas de cristal violeta durante 1min.

Lavar cuidadosamente el preparado con agua destilada o agua caliente.

Cubrir el frotis con 2 gotas de lugol de Gram durante 30".

Lavar cuidadosamente el frotis con agua.

Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no que no fluya la tintura.

inmediatamente  lavar con agua.

Aplica 2 gota de safronina durante 30 seg.

lavar el preparado con agua.

Secar de forma suave.

TINCIÓN SIMPLE

Se usa un único colorante, es de tipo básico. Se utiliza solamente para incrementar el contraste.

Tinción de Giemsa

La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el Plasmodium falciparum. También se emplea la modificación de Wright. Este método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial.

Fundamento:

Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.

Preparacion:

Para muestras histológicas, los mejores resultados se obtienen en muestras fijadas con formol, incluidas en parafina y cortadas entre 3 y 6 micras. Las reacciones metacromáticas, se definen como colorantes que al entrar en contacto con la sustancia a teñir cambian su color original. el prototipo de esta característica son el azul de metileno como bien dice la bibliografía y el azul de tolouidina. Su aspecto en el corte histologico es púrpura - rojizo. Es usado además de los extendidos de sangre en los cortes de cartílago Hialino por la gran carga de glucosaminoglucanos ácidos ya que están dos sustancias son básicas.

Procedimiento:

Desparafinar e hidratar.

Aplicar solución de trabajo de Giemsa durante 10 minutos.

Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios.

Resultados:

Citoplasma: rosa

Núcleos: azul

Eritrocitos: rosa - naranja

Gránulos de las células cebadas: púrpura

Bacterias: azul

Parásitos: azul

Frotis

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1.      Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.

2.      Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.

3.      Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS

4.      Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases.

Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.

TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO

5.      Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células.

6.      Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo.

7.      Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.

8.      Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión. 

Características de los cultivos (crecimiento)

Entre las principales características de las células bacterianas, cuentan el tamaño, la forma, la estructura y el modo en que se agrupan. Estos caracteres constituyen la morfología de la célula. El tamaño de las bacterias a pesar  de sus dimensiones , microscópicas pueden medirse con exactitud.

Por lo general las células individuales tienen forma esférica, cilíndrica o helicoidal  según su especie.

Las células bacterianas esféricas o elipsoidales, se denominan cocos  y algunos de ellos pueden ser:

Diplococos= parejas de células

Estreptococos= hileras de células
Tetradas = cuatro células dispuestas en cuadro
Estafilococo= grupos irregulares , semejantes a racimos de uvas
Sarcinas= agrupamiento en cubo con ocho o más  células

Características tan importantes como el color (cromogénesis), la abundancia del crecimiento y aún el olor de medio de cultivo, nos brindan datos tan importantes para la identificación de un microorganismo deconocido.

Para determinar las caracterísitcas de crecimiento en un cultivo puro es necesrario observar los siguientes tipos de cultivos.

1.                  Colonias en agar nutritivos(cultivo en placas)

2.                 Crecimiento en agar inclinado

3.                 Crecimiento en caldo

4.                 Crecimiento en picado de gelatina.

 Aspectos a considerar en el crecimiento de cada uno de los medios es muy importante.

1.                  Colonias en placa de agar.

·                     Tamaño 

·                     Márgen o borde

·                     Elevación 

·                     Cromogénesis o pigmentación

·                     Caracteres ópticos

      2. Crecimiento en estrias sobre agar

·                     Cantidad

·                     Margen o borde de crecimiento

·                     Consistencia 

·                     Cromogénesis o pigmentación

       3. Crecimiento en caldo nutritivo

·                     Valor de crecimiento: escaso, moderado , abundante.

·                     Distribución del crecimiento en el caldo

·                     Olor: pútrido, de frutas, aromático , imperceptible,tortilla.

      4. Crecimiento en gelatina

·                     Crecimiento a lo largo de la linea de siembra

·                     Licuación de la gelatina